مواد مصرفی استخراج

برای استخراج DNA و RNA از نمونه‌های بیولوژیکی، مواد و معرف‌های مختلفی مورد نیاز است که هر کدام نقش خاصی در جداسازی و خالص‌سازی اسیدهای نوکلئیک دارند. اگرچه پروتکل‌های استخراج ممکن است بسته به نوع نمونه (مانند خون، بافت، سلول‌های کشت شده، گیاهان و غیره) و کیت استخراج مورد استفاده کمی متفاوت باشند، اما مواد اصلی معمولاً یکسان هستند.

مواد لازم برای استخراج DNA:

1.بافر لیز (Lysis Buffer): نقش:شکستن غشای سلولی و هسته‌ای برای آزادسازی DNA. محتویات معمول: شوینده‌های قوی (مانند SDS یا Triton X-100) برای حل کردن لیپیدها و پروتئین‌ها، نمک‌ها (مانند NaCl) برای حفظ ساختار DNA و تنظیم یون‌ها، و مواد بافری (مانند Tris-HCl) برای حفظ pH آنزیم پروتئیناز K (Proteinase K):اغلب به بافر لیز اضافه می‌شود. این آنزیم پروتئین‌ها، به ویژه هیستون‌هایی که DNA را احاطه کرده‌اند و همچنین آنزیم‌های DNase را تجزیه می‌کند و به خالص‌سازی DNA کمک می‌کند.

2.مواد رسوب‌دهنده (Precipitating Agents): نقش: جدا کردن DNA از سایر اجزای محلول پس از لیز کردن سلول. مثال: پتاسیم استات (Potassium Acetate) یا سدیم استات (Sodium Acetate). این نمک‌ها با شوینده‌ها کمپلکس تشکیل داده و پروتئین‌ها و سایر ناخالصی‌ها را رسوب می‌دهند، در حالی که DNA در محلول باقی می‌ماند.

3.اتانول (Ethanol) یا ایزوپروپانول (Isopropanol): نقش: رسوب دادن DNA از محلول. DNA در غلظت‌های بالای الکل نامحلول است و به صورت توده‌ای قابل مشاهده رسوب می‌کند. غلظت:معمولاً از اتانول 95-100% یا ایزوپروپانول استفاده می‌شود.

4.محلول شستشو (Washing Buffer): نقش:حذف نمک‌ها و ناخالصی‌های باقی‌مانده از رسوب DNA. محتویات معمول:اتانول (معمولاً 70-80%) به همراه نمک‌ها در غلظت پایین. این غلظت اتانول باعث می‌شود DNA در ستون یا محلول باقی بماند در حالی که نمک‌ها شسته می‌شوند.

5.محلول الوشن (Elution Buffer): نقش:حل کردن DNA خالص شده از رسوب یا ستون. محتویات معمول: آب مقطر بدون نوکلئاز (Nuclease-free water) یا بافر TE (Tris-EDTA). EDTA با یون‌های فلزی دو ظرفیتی مانند Mg²⁺ که برای فعالیت DNase ضروری هستند، کمپلکس تشکیل داده و DNase را مهار می‌کند.

مواد لازم برای استخراج RNA:

استخراج RNA به دلیل حساسیت بالای RNA به تخریب توسط آنزیم‌های RNase، نیاز به دقت و مواد خاص‌تری دارد.

1.بافر لیز حاوی مهارکننده‌های RNase (Lysis Buffer with RNase Inhibitors): نقش:شکستن غشای سلولی و بافتی و مهم‌تر از همه، غیرفعال کردن تمامی آنزیم‌های RNase موجود در نمونه و محیط کار. محتویات معمول: گوانیدین تیوسیانات (Guanidinium Thiocyanate) یا گوانیدین هیدروکلراید (Guanidinium Hydrochloride):عوامل دناتوره کننده قوی که هم سلول‌ها را لیز می‌کنند و هم RNaseها را غیرفعال می‌نمایند. فنل (Phenol) و کلروفورم (Chloroform): برای استخراج پروتئین‌ها و لیپیدها. مخلوط فنل-کلروفورم در pH پایین (حدود 4-4.5) استفاده می‌شود که در این pH RNA نامحلول و در فاز آبی باقی می‌ماند. سولفات سدیم لوریل (Sodium Lauryl Sulfate - SDS): یک شوینده آنیونی که به لیز سلولی و دناتوره کردن پروتئین‌ها کمک می‌کند. بتا-مرکاپتواتانول (β-Mercaptoethanol - BME): یک عامل کاهنده که پیوندهای دی‌سولفیدی در پروتئین‌ها (از جمله RNaseها) را می‌شکند و به غیرفعال کردن آنها کمک می‌کند. مهارکننده‌های RNase تجاری: بسیاری از کیت‌های استخراج RNA حاوی مهارکننده‌های RNase آماده هستند که به طور خاص آنزیم‌های RNase را مهار می‌کنند.

2.اتانول (Ethanol): نقش:رسوب دادن RNA از محلول پس از پردازش با بافر لیز و استخراج با فنل-کلروفورم. غلظت:معمولاً از اتانول غلیظ (95-100%) استفاده می‌شود.

3.محلول شستشو (Washing Buffer): نقش: شستشوی رسوب RNA برای حذف نمک‌ها و ناخالصی‌های باقی‌مانده. محتویات معمول:اتانول 70-80%.

محلول الوشن (Elution Buffer): نقش: حل کردن RNA خالص شده. محتویات معمول: آب مقطر بدون نوکلئاز یا بافر DEPC-treated water (آب تیمار شده با دی اتیل پیرو کربنات برای غیرفعال کردن RNaseها). بافر TE نیز گاهی استفاده می‌شود، اما باید اطمینان حاصل شود که EDTA با واکنش‌های بعدی (مانند RT-PCR) تداخل نداشته باشد. نکات کلیدی برای جلوگیری از تخریب RNA:

استفاده از ظروف و مواد شیمیایی بدون RNase: تمام ظروف، لوله‌ها، سرسمپلرها و محلول‌ها باید عاری از آلودگی RNase باشند. محیط کار تمیز: دست‌ها و سطوح کار باید تمیز باشند و ترجیحاً از دستکش‌های بدون پودر استفاده شود. کار سریع:مراحل استخراج باید تا حد امکان سریع انجام شوند تا زمان برای تخریب RNA کاهش یابد. استفاده از مهارکننده‌های RNase: استفاده از محلول‌های لیز کننده حاوی مهارکننده‌های RNase و همچنین افزودن مهارکننده‌های RNase به محلول‌های دیگر در صورت نیاز. نگهداری مناسب نمونه‌ها: نمونه‌ها باید بلافاصله پس از جمع‌آوری در محلول‌های تثبیت کننده RNA مانند RNA Later یا در فریزر نگهداری شوند.