آنزیم های کشت سلولی

•کشت سلولی چیست؟ کشت سلول (Cell Culture) به فرایند کشت یاخته‌های پروکاریوتی یا یوکاریوتی در یک محیط کشت، گفته می‌شود. این اصطلاح بیشتر در مورد کشت یاخته‌های جانداران چندسلولی کاربرد دارد. در این فرایند، یاخته‌ها در محیط آزمایشگاهیو تحت شرایط کنترل‌شده، رشد داده می‌شوند. •آنزیم های کشت سلولی چیست؟ از جمله مهم‌ترین آنزیم‌های مورد استفاده در فرایند استخراج، می‌توان به کلاژنازها، تریپسین یا پروناز اشاره کرد که ماتریکس خارج سلولی را می‌شکنند. سلول‌هایی که به‌طور مستقیم از خود هدف کشت داده می‌شوند به‌عنوان سلول‌های نسل اول یا پرایمری شناخته می‌شوند. اکثر کشت‌های سلولی به جز آن‌هایی که از تومور گرفته می‌شوند، طول عمر محدودی دارند. یک رده سلولی نامیرا می‌تواند با ایجاد جهش تصادفی یا هدفمند (مانند بیان مصنوعی ژن تلومراز) به‌طور نامحدودی تکثیر گردد و به‌عنوان نماینده‌ای از انواع سلولی خاص پایه‌ریزی شود. •آنزیم کشت سلولی کلاژناز چیست؟ کلاژنازها آنزیم‌هایی هستند که پیوندهای پپتیدی در کلاژن را می‌شکنند. و با تخریب ساختارهای خارج سلولی در پاتوژنز باکتری‌هایی مانند کلستریدیوم کمک می‌کنند. آن‌ها به‌عنوان یک عامل بیماری‌زا در نظر گرفته می‌شوند که گسترش گانگرن گازی را تسهیل می‌کند. •شرایط نگه داری آنزیم های کشت سلولی چیست؟ •شرایط خاص کشت سلول چیست؟ •آنزیم تریپسین چیست؟ •برای کشت سلول چقدر آنزیم تریپسین نیاز است؟ •چرا در کشت سلول از آنزیم تریپسین استفاده میشود؟ • آنزیم تریپسین در کدام مرحله کشت سلولی مورد استفاده قرار میگیرد؟ • اگر در کشت سلول از آنزیم تریپسین استفاده نشود، چه اتفاقی برای سلول ها رخ می دهد؟ •دمای نگه داری آنزیم تریپسین، کلاژناز و آنزیم های کشت سلولی چند درجه سانتی گراد است؟ تریپسین (Trypsin)، آنزیمی است پروتئینی که از سلولهای لوزالمعده به صورت پرو آنزیم و غیرفعال ترشح می‌شود و به هضم پروتئین‌ها کمک می‌کند. تریپسین (Trypsin)

مکانیسم عمل:

تریپسین یک سرین پروتئاز است که پیوندهای پپتیدی را در سمت کربوکسیل اسید آمینه‌های لیزین و آرژنین هیدرولیز می‌کند. در کشت سلولی، تریپسین برای جدا کردن سلول‌های چسبنده از سطح کشت یا از یکدیگر استفاده می‌شود. سلول‌های چسبنده (Adherent cells) پروتئین‌های چسبندگی سطحی مانند فیبرونکتین، ویترونکتین و لامینین را تولید می‌کنند که باعث اتصال آن‌ها به سطح کشت می‌شود. تریپسین این پروتئین‌ها را تجزیه می‌کند و باعث جدا شدن سلول‌ها می‌شود.

کاربردها:

جدا کردن سلول‌های چسبنده: تریپسین به طور معمول برای جدا کردن سلول‌های چسبنده از فلاسک‌ها، پلیت‌ها و سایر ظروف کشت سلولی استفاده می‌شود. تهیه سوسپانسیون تک سلولی: تریپسین می‌تواند برای تهیه سوسپانسیون تک سلولی از بافت‌ها یا توده‌های سلولی استفاده شود. مزایا:

مؤثر: تریپسین در جدا کردن سلول‌های چسبنده بسیار مؤثر است. مقرون به صرفه: تریپسین معمولاً ارزان‌تر از کلاژناز است. معایب:

تأثیرات سمی: تریپسین می‌تواند برای سلول‌ها سمی باشد، به خصوص اگر برای مدت طولانی در معرض آن قرار گیرند. تریپسین می‌تواند به پروتئین‌های سطحی سلول آسیب برساند و باعث کاهش زنده ماندن سلول‌ها شود. نیاز به مهارکننده‌ها: فعالیت تریپسین باید پس از جدا شدن سلول‌ها با استفاده از یک مهارکننده مانند سرم جنین گاوی (FBS) یا مهارکننده‌های خاص تریپسین مهار شود. حساسیت سلول‌ها: برخی از انواع سلول‌ها نسبت به تریپسین حساس‌تر هستند و ممکن است آسیب ببینند. نکات مهم در استفاده از تریپسین:

غلظت: غلظت تریپسین باید بهینه باشد تا سلول‌ها به طور مؤثر جدا شوند و آسیب نبینند. غلظت معمول تریپسین در کشت سلولی 0.05% تا 0.25% است. زمان: زمان قرار گرفتن سلول‌ها در معرض تریپسین باید به حداقل برسد تا آسیب سلولی کاهش یابد. معمولاً 1 تا 5 دقیقه کافی است. دما: فعالیت تریپسین وابسته به دما است. معمولاً از تریپسین در دمای 37 درجه سانتی‌گراد استفاده می‌شود، اما می‌توان از دمای اتاق نیز استفاده کرد. مهارکننده: پس از جدا شدن سلول‌ها، فعالیت تریپسین باید با استفاده از یک مهارکننده متوقف شود. سرم جنین گاوی (FBS) معمولاً به عنوان مهارکننده استفاده می‌شود. EDTA: اغلب تریپسین به همراه EDTA (اتیلن دی آمین تترا استیک اسید) استفاده می‌شود. EDTA یک عامل کیلیت کننده است که یون‌های کلسیم و منیزیم را حذف می‌کند. این یون‌ها برای چسبندگی سلول‌ها به یکدیگر ضروری هستند. حذف این یون‌ها باعث افزایش کارایی تریپسین در جدا کردن سلول‌ها می‌شود. کلاژناز (Collagenase) مکانیسم عمل:

کلاژناز یک آنزیم است که کلاژن را تجزیه می‌کند. کلاژن یک پروتئین ساختاری اصلی در ماتریکس خارج سلولی (ECM) است. ماتریکس خارج سلولی شبکه‌ای از پروتئین‌ها و سایر مولکول‌ها است که سلول‌ها را در بافت‌ها و اندام‌ها احاطه کرده است. کلاژناز با تجزیه کلاژن، سلول‌ها را از ماتریکس خارج سلولی جدا می‌کند.

کاربردها:

جدا کردن سلول‌ها از بافت‌ها: کلاژناز به طور معمول برای جدا کردن سلول‌ها از بافت‌ها استفاده می‌شود. این آنزیم به خصوص برای بافت‌هایی که حاوی مقدار زیادی کلاژن هستند (مانند پوست، استخوان و غضروف) مناسب است. تهیه سوسپانسیون تک سلولی: کلاژناز می‌تواند برای تهیه سوسپانسیون تک سلولی از بافت‌ها استفاده شود. کشت سه بعدی سلول‌ها: کلاژناز برای جدا کردن سلول‌ها از داربست‌های کشت سه بعدی (3D culture scaffolds) استفاده می‌شود. مزایا:

ملایم‌تر: کلاژناز معمولاً ملایم‌تر از تریپسین است و کمتر به سلول‌ها آسیب می‌رساند. حفظ عملکرد سلول: کلاژناز می‌تواند به حفظ عملکرد سلول‌ها کمک کند، به خصوص در مواردی که حفظ ساختار ماتریکس خارج سلولی مهم است. معایب:

گران‌تر: کلاژناز معمولاً گران‌تر از تریپسین است. پیچیدگی: کلاژنازها اغلب به صورت مخلوطی از ایزوآنزیم‌ها هستند و ممکن است حاوی سایر آنزیم‌های پروتئولیتیک باشند که می‌توانند بر عملکرد و سمیت آنزیم تأثیر بگذارند. نیاز به بهینه‌سازی: شرایط بهینه برای استفاده از کلاژناز (غلظت، زمان، دما) بسته به نوع بافت و سلول متفاوت است و نیاز به بهینه‌سازی دارد. نکات مهم در استفاده از کلاژناز:

نوع کلاژناز: انواع مختلفی از کلاژناز وجود دارد که هر کدام دارای ویژگی‌های خاصی هستند. انتخاب نوع مناسب کلاژناز بسته به نوع بافت و سلول مهم است. غلظت: غلظت کلاژناز باید بهینه باشد تا سلول‌ها به طور مؤثر جدا شوند و آسیب نبینند. زمان: زمان قرار گرفتن سلول‌ها در معرض کلاژناز باید بهینه باشد. معمولاً زمان بیشتری نسبت به تریپسین نیاز است. دما: فعالیت کلاژناز وابسته به دما است. معمولاً از کلاژناز در دمای 37 درجه سانتی‌گراد استفاده می‌شود. خلوص: اطمینان از خلوص کلاژناز برای جلوگیری از اثرات نامطلوب سایر آنزیم‌ها ضروری است.